Chuyên đề Sinh học 12 Chân trời sáng tạo Bài 2: Tách chiết DNA từ tế bào

Các nhà khoa học có thể thu nhận được các phân tử DNA như mong muốn thông qua các phương pháp tách chiết DNA. Các phương pháp này đều dựa trên nguyên lí cơ bản là giải phóng DNA còn nguyên vẹn vào dung dịch tách chiết, loại bỏ các tạp chất để thu nhận DNA tinh sạch.

- Quy trình cơ bản tách chiết DNA từ tế bào gồm các bước:

+ Bước 1 - Chuẩn bị mẫu sinh phẩm: nguồn thu nhận DNA có thể từ tế bào vi khuẩn, mô thực vật hoặc động vật.

+ Bước 2 - Li giải tế bào: phá vỡ màng sinh chất và màng nhân (ở tế bào nhân thực) bằng các tác nhân vật lí hoặc hóa học.

+ Bước 3 - Loại bỏ các thành phần không mong muốn: Loại bỏ các thành phần không mong muốn như carbohydrate, lipid, protein, RNA,... bằng dung môi hữu cơ, gắn DNA lên cột silica, dùng các hạt từ,…

+ Bước 4 - Thu nhận DNA: rửa dịch chiết DNA bằng cách bổ sung các chất để gây kết tủa DNA để loại bỏ các tạp chất còn sót lại để thu nhận DNA tinh khiết.

- Nguyên lí cơ bản của phương pháp tách chiết DNA là giải phóng DNA còn nguyên vẹn vào dung dịch tách chiết, loại bỏ các tạp chất để thu nhận DNA tinh sạch.

- Mục đích của quá trình li giải tế bào: giải phóng DNA vào dịch chiết.

- Cơ chế của quá trình li giải tế bào: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân bằng các chất tẩy lưỡng cực, có thể kết hợp với các enzyme như lysozyme, cellulase, chitinase,… để tăng hiệu quả. Ngoài ra, đối với tế bào thực vật cần sử dụng thêm các biện pháp cơ học (nghiền bằng cối, dùng máy xay) hoặc sử dụng enzyme để phá vỡ thành tế bào; mô động vật cần được xử lí bằng enzyme để phá hủy các mô liên kết, cắt bỏ phần mô chết và phần thừa (như mỡ).

Do cấu trúc của các loại tế bào có sự khác nhau nên trong quá trình li giải có thể sử dụng kết hợp một số phương pháp vật lí:

- Tế bào vi khuẩn: quy trình tách chiết đơn giản.

- Tế bào mô thực vật và tế bào động vật: có kích thước lớn nên thường phải nghiền nhỏ trong môi trường chứa nitrogen lỏng thành các hạt mịn để dễ dàng tách chiết DNA.

+ Tế bào thực vật: cần sử dụng thêm các biện pháp cơ học (nghiền bằng cối, dùng máy xay) hoặc sử dụng enzyme để phá vỡ thành tế bào.

+ Tế bào động vật: cần được xử lí bằng enzyme để phá hủy các mô liên kết, cắt bỏ phần mô chết và phần thừa (như mỡ).

Các bước loại bỏ protein:

- Bước 1: Cho hỗn hợp dung môi hữu cơ phenol : choroform (tỉ lệ 1 : 1) để gây biến tính và kết tủa protein.

- Bước 2: Lắc mạnh cho đồng nhất dung môi với dung dịch chiết.

- Bước 3: Li tâm để tách protein và lipid ra khỏi hỗn hợp DNA và RNA.

- Bước 4: Dùng proteinase K để loại bỏ các protein còn lại.

- Bước 5: Dùng pipette hút pha nước để thu nhận hỗn hợp DNA và RNA, tiếp tục loại bỏ các RNA bằng các enzyme ribonuclease.

Li tâm dùng để phân tách hỗn hợp các chất thành các phần riêng biệt, các thành phần có tỉ trọng khác nhau sẽ được tách thành các lớp (pha) khác nhau, nhờ đó có thể loại bỏ được các thành phần không mong muốn và thu nhận DNA tinh sạch.

- Ưu điểm: Hiệu quả tách chiết cao, chi phí thấp, có thể áp dụng để tách chiết DNA từ nhiều mẫu sinh phẩm khác nhau.

- Nhược điểm: Hóa chất sử dụng có tính độc, tốn nhiều thời gian, phụ thuộc nhiều vào kĩ thuật của người tiến hành tách chiết.

- Quy trình cơ bản tách chiết DNA bằng phương pháp cột silica gồm các bước:

+ Bước 1: Li giải tế bào.

+ Bước 2 - Gắn cột: Hỗn hợp chứa DNA thu được sau quá trình li giải sẽ được chuyển lên màng silica thông qua quá trình li tâm với tốc độ 13 000 vòng/phút, các thành phần còn lại sẽ đi qua màng và chuyển sang đáy ống li tâm. Tiến hành loại bỏ tạp chất và tách DNA ra khỏi dung dịch.

+ Bước 3 - Rửa: Loại bỏ các tạp chất để thu được DNA tinh sạch bằng ethanol (đối với mẫu sinh phẩm lấy từ vi khuẩn) hoặc bằng muối chaotropic và ethanol (đối với mẫu sinh phẩm lấy từ động, thực vật).

+ Bước 4 - Thu nhận DNA: Li tâm làm khô cột silica rồi tiến hành rửa giải để thu nhận DNA bằng dung dịch muối Tris 10mM ở pH 8 – 9 hoặc nước.

- Nguyên lí của tách chiết DNA bằng phương pháp cột silica là sử dụng các muối chaotropic có vai trò hỗ trợ cho quá trình liên kết giữa DNA với các hạt silica và được giữ lại, các thành phần khác (polysaccharide, protein,...) không thể gắn lên màng sẽ bị loại bỏ để thu nhận DNA tinh sạch.  

Bước làm khô cột silica có tác dụng loại bỏ ethanol ra khỏi dung dịch chiết và tăng hiệu suất quá trình rửa giải. Nếu bỏ qua bước này, ethanol không bị loại bỏ sẽ gây khó khăn cho việc tách DNA ra khỏi màng silica, đồng thời nếu lượng ethanol dư thừa sẽ khiến nucleic acid dễ bị đứt gãy thành các mảnh nhỏ làm giảm hiệu quả của quá trình tách chiết.

Trong quá trình tách chiết DNA, nếu các yếu tố nói trên không được đảm bảo sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả tách chiết (lượng DNA được thu hồi thấp, độ tinh sạch của DNA thấp). Cụ thể:

- Tế bào không được li giải hoàn toàn sẽ ảnh hưởng đến việc giải phóng DNA ra khỏi tế bào → giảm lượng DNA thu được.

- Nồng độ ethanol được sử dụng:

+ Nồng độ quá cao: gây đứt gãy nucleic acid → giảm lượng DNA thu được.

+ Nồng độ quá thấp: khó loại bỏ được các thành phần không mong muốn → giảm độ tinh sạch của DNA.

- Quá trình gắn DNA lên màng silica không đúng sẽ làm giảm lượng DNA được gắn lên màng → DNA không được giữ lại sẽ bị rửa trôi → giảm lượng DNA thu được.

- Mẫu DNA bị nhiễm protein do protein không được loại bỏ hoàn toàn → giảm độ tinh sạch của DNA.